Née Jeanne Roques, elle grandit dans un milieu d’artistes cultivés et progressistes. Vers l’âge de vingt ans, elle se produit dans des revues et des opérettes aux théâtres de l’Odéon et du Châtelet et débute en 1913 au cinéma, sous le pseudonyme de Musidora – en référence à l’héroïne du roman de Théophile Gautier Fortunio -.
En 1914, alors qu’elle est danseuse aux Folies Bergères, le réalisateur Louis Feuillade la remarque et l’engage pour tourner dans des vaudevilles et des films patriotiques avant de lui donner le rôle féminin de son ciné-feuilleton Les Vampires dans lequel elle incarne une femme fatale, Irma Vep – anagramme de « vampire »-, qui devient très rapidement un archétype cinématographique, celui de la « vamp ». En parallèle, elle écrit pour des revues de cinéma et souhaitant se défaire de son personnage sulfureux, elle se lance dans la réalisation.
Très amie avec Colette, elle adapte plusieurs de ses œuvres dont Minne, inspiré de L’Ingénue libertine, film inachevé, faute de moyens financiers ou encore La Vagabonde en 1917, pour lequel la production lui impose un coréalisateur, Eugenio Perego. Pour gagner son indépendance, elle créée sa société de production en 1919 : la Société des Films Musidora, ce qui lui permettra de tourner Vicenta puis Pour Don Carlos en Espagne, dans lequel elle tient le rôle principal. Le film rencontre un succès mitigé, fragilisant sa société. Tombée amoureuse du torero Antonio Caňero, elle s’installe dans la péninsule ibérique et y tourne Soleil et ombre avec son compagnon, un drame passionnel dans lequel deux femmes se disputent l’amour d’un torero et où elle interprète les deux rôles. Mais le film n’obtient pas le succès escompté.
Séparée de son partenaire, elle rentre en France en 1926. Ruinée par ses échecs, elle abandonne alors le cinéma pour se consacrer à la littérature et la peinture. En 1943, Henri Langlois lui confie la direction de la Commission de recherche historique du cinéma qu’il vient de créer et elle devient directrice du Service de la documentation et des relations avec la presse à la Cinémathèque française, mission qu’elle effectuera jusqu’à sa mort en 1957.
Artiste complète, Musidora a su imposer sa personnalité de femme libre et indépendante, dans un milieu essentiellement masculin.

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